Le système CupE de la voie chaperonne - "usher" de Pseudomonas aeruginosa : assemblage, fonction et régulation. Identification du système à deux composants PprA-PprB et caractérisation de son régulon

La bactérie à Gram négatif Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste possédant de nombreux systèmes moléculaires contribuant à sa pathogénicité et à son développement selon un mode de vie en biofilm, qui permet une meilleure résistance aux défenses de l’hôte et aux antibiotiques. Parmi ces systèmes, on retrouve les fimbriae assemblés par la voie chaperonne – « usher » (CU). La voie CU implique une protéine formant un pore dans la membrane externe, la protéine « usher », une chaperonne périplasmique et au moins une sous unité piline qui va être assemblée en fimbriae à la surface de la bactérie.Mon travail de thèse a principalement porté sur l’étude du cluster de gènes cupE, qui code pour un système CU du clade σ-fimbriae. Ce système est différent des quatre autres systèmes CU cupA – cupD déjà caractérisés chez P. aeruginosa et appartenant au clade γ4-fimbriae. Indépendamment des gènes codant la protéine « usher » et la chaperonne, ce cluster comprend quatre autres gènes qui codent pour des sous unités pilines atypiques (une piline majeure, deux pilines mineures et une adhésine). Nous avons montré que le système CupE est fonctionnel et permet l’assemblage de fimbriae à la surface de la cellule, assemblage (oligomérisation de la sous unité majeure en fimbirae) pour lequel nous avons montré que l’adhésine est essentielle, au contraire des deux sous unités mineures. Ces fimbriae jouent un rôle important dans la formation et la structuration du biofilm, tant à des étapes précoces que lors des étapes tardives. Excepté une piline mineure, tous les éléments de la fibre sont importants pour la formation du biofilm. Ce cluster de gènes est spécifiquement exprimé en conditions de formation du biofilm et par une approche de mutagenèse aléatoire par transposition, le système à deux composants (TCS) PprA – PprB a été identifié comme un régulateur positif potentiel de ce cluster. L’implication de ce TCS dans la régulation de cupE a été vérifiée et nous avons pu démontrer par des techniques de retard sur gel que ce contrôle est direct et que PprB se lie sur des boites putatives en amont du +1 de transcription de cupE défini par 5’-RACE PCR.Ce TCS ayant été identifié au préalable comme un régulateur positif de pili de type IVB Flp, eux-mêmes acteurs du biofilm chez P. aeruginosa, nous avons caractérisé le régulon du régulateur de réponse PprB. Parmi les nouvelles cibles régulées positivement par PprB, nous avons identifié deux cibles nouvelles dont nous avons débuté la caractérisation. La première est un opéron de quatre gènes codant pour un transporteur ABC impliqué dans la résistance aux antibiotiques spécifiquement en conditions de biofilm et pour une protéine de haut poids moléculaire, substrat potentiel de ce transporteur ABC. Cette protéine, que nous avons renommé AdhA, est effectivement sécrétée par le transporteur ABC et est impliquée dans la cohésion des cellules au cours de la formation du biofilm. Il s’agit d’une nouvelle adhésine participant à la structuration du biofilm chez P. aeruginosa. La seconde cible est un gène codant pour une protéine que nous avons renommée Hvn, homologue aux halovibrines HvnA et HvnB de Vibrio fischeri. Le sécrétome d’une souche délétée du gène hvn est considérablement modifié et son absence d’effet sur la morphologie des cellules eucaryotes par rapport au sécrétome de la souche PAO1 suggère que la protéine Hvn pourrait jouer un rôle dans la virulence de P. aeruginosa.Au travers de ce travail, nous avons caractérisé le système CupE de la voie CU chez P. aeruginosa et montré qu’il assemblait des fimbriae atypiques pouvant avoir un rôle dans les différentes phases de la formation du biofilm et qu’il était sous la régulation directe et positive du TCS PprA – PprB. [...]The Gram negative opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa is equipped with molecular systems that contribute to bacterial pathogenesis and biofilm development, this latter being associated with increased resistance to host defenses and antibiotics. Among them, are the fimbriae assembled by the chaperone usher (CU) pathway. The CU pathway involves a protein called the usher that forms a pore in the outer membrane, a periplasmic chaperone and at least one fimbrial subunit assembled into fimbriae at the cell surface.My PhD study mainly focuses on the cupE gene cluster, encoding a CU system from the σ-fimbrial clade. This system is different from all the CU systems cupA – cupD already characterized in P. aeruginosa, all belonging to the γ4-fimbrial clade. Independently from the genes encoding the usher and the chaperone, this cluster comprises four other genes encoding atypical pilins (one major pilin, two minor pilins and one adhesin). We showed that this CupE system is functional and allows the assembly of fimbriae at the cell surface. Unlike the two minor pilins, the adhesin is necessary for the fimbriae assembly (oligomerisation of the major subunit into the fiber). These fimbriae play an important role in biofilm formation and structuration, at early and late steps. Except one minor pilin, all subunits are important for the CupE-dependent biofilm formation. This gene cluster is specifically expressed in biofilm conditions and a random transposon mutagenesis allowed us to identify the two component system (TCS) PprA-PprB as an activator of cupE genes. We verified the implication of this TCS in cupE regulation and, using EMSA, we showed that the PprB control on cupE is direct, with PprB binding onto putative boxes upstream the transcription start of cupE, defined by 5’-RACE PCR.As this TCS was identified before as a positive regulator for the type IVB Flp pilus, another actor in the biofilm formation, we defined the PprB regulon. Among the new targets positively controlled by PprB, we found two new targets that we started to characterize. The first one is a four gene operon encoding an ABC transporter involved in antibiotic resistance specifically in biofilm conditions and a high molecular weight protein, a potential substrate for this ABC transporter. This protein that we renamed AdhA is indeed secreted by this ABC transporter and is implicated in the cohesion between cells during the biofilm formation. It is a new adhesin participating into the biofilm structuration of P. aeruginosa. The second target is a gene encoding a protein that we renamed Hvn, and homologous to HvnA and HvnB halovibrins from Vibrio fischeri. Secretome from an hvn mutant is highly modified and the lack of effect on eukaryotic cell’s morphology in comparison to the PAO1 secretome suggests the Hvn protein can play a role in P. aeruginosa virulence.Through this work, we characterized the cupE system from the CU pathway and showed that this system can assemble atypical fimbriae having a role in the different phases of biofilm formation. This system is under the positive and direct regulation of the TCS PprA – PprB.[...